Artigo Final - Mário M. Bonci

CASUÍSTICA E CORRELAÇÃO ENTRE CULTIVO MICROBIOLÓGICO E MICROSCOPIA DIRETA NA IDENTIFICAÇÃO DE DERMATÓFITOS ISOLADOS POR LABORATÓRIO DE DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO VETERINÁRIO

RESUMO - Os dermatófitos são fungos queratinofílicos causadores da dermatofitose, doença que requer diversas ferramentas para seu diagnóstico, como o exame direto de amostras e cultivo microbiológico. Por tratar-se de importante zoonose, acometendo principalmente pessoas imunocomprometidas e contactantes de animais, é de suma importância a vigilância de dados sobre as dermatofitoses também em medicina veterinária, bem como o aprimoramento e correta utilização e integração das ferramentas de diagnóstico, contribuindo para saúde e bem-estar dos seres vivos e ambiente. O objetivo deste trabalho é apresentar a correlação entre o cultivo microbiológico positivo para dermatófitos e o resultado da microscopia direta das amostras de pelos e crostas por isolados do Laboratório de Diagnóstico Microbiológico Veterinário da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro no período de 2012 a 2016. Analisou-se tabelas digitalizadas com dados sobre pacientes e resultados obtidos a partir das amostras recebidas. Foram 162 cultivos positivos, 93 pertenciam a cães e 69 a felinos domésticos, sendo obtidos 173 isolados de dermatófitos. Das amostras com cultura positiva, 42 tiveram a visualização de hifas e artroconídios durante a microscopia direta dos pelos e crostas. Do total de isolados, Microsporum canis prevaleceu com 107 isolados, seguido por 38 Trichophyton spp., 27 fungos do Complexo Nannizzia gypsea e 1 isolado de Nannizzia nana. De 9 amostras foram obtidos 2 dermatófitos distintos. Aliada ao exame direto, o cultivo microbiológico mostra-se ferramenta fundamental no diagnóstico e identificação do agente etiológico da dermatofitose.

Palavras-Chave: dermatopatias; artroconídios; exame direto; dermatofitose; Microsporum.

INTRODUÇÃO

Os dermatófitos formam grupo distinto de fungos que necessitam e utilizam a queratina para seu desenvolvimento. Causam lesões em pele e anexos queratinizados de animais e humanos, tendo reconhecido poder zoonótico. Os principais agentes envolvidos na dermatofitose em animais são Microsporum canis, N. gypsea e Trichophyton spp. (REF).

Os sinais clínicos nos animais costumam aparecer em situações de imunossupressão, como associação com vírus, como o da leucemia e imunodeficiência felina. As lesões surgem com desenvolvimento centrífugo, sendo caracterizadas por áreas arredondadas e alopécicas, com pontos inflamatórios na periferia (REF). Estas podem regredir naturalmente, mas o tratamento tópico associado ao sistêmico, auxiliam em casos mais graves. As drogas mais comuns utilizadas são miconazol e itraconazol (REF).

As técnicas de diagnóstico da dermatofitose em em animais variam desde os métodos utilizados pelos médicos veterinários clínicos, como auxílio de lâmpada de Wood e microscopia direta de amostras, aos exames laboratorias, como cultura fúngica e reação em cadeia da polimerase (PCR) (REF).

A microscopia direta dos pelos e crostas é realizada tanto pelos clínicos, quanto pelos microbiologistas. Tradicionalmente, utiliza-se tratamento das amostras com soluções clarificantes, KOH e NaOH, em concentrações de 15 a 20%, facilitando a visualização de artroconídios e outras estruturas fúngicas (AHMADI et al., 2015). Outros examinadores recomendam a utilização de KOH na concentração de 10% misturado ao azul de metileno, destacando os artroconídios e facilitando os exames (KHALED et al., 2015), e alguns substituem o azul de metileno por dimetilsulfóxido (DMSO), potencializando a ação clarificante do KOH (MIRANDA & SILVA, 2005). Newbury & Moriello (2014) recomendam a utilização de óleo mineral, descartando o uso de soluções clarificantes durante a microscopia direta dos pelos. Soluções de maior custo podem ser empregadas, como a utilização de agentes fluorescentes, como Calcofluor-white® e Blankophor® (FRYMUS et al., 2013).

A cultura fúngica é o método mais barato e prático de obter-se o agente envolvido na infecção. Porém, para Frymus et al. (2013) a cultura em agar Sabouraud-dextrose ainda é o método ouro para diagnóstico das dermatofitoses, por tratar-se de técnica de boa sensibilidade e possibilitar identificar os gêneros e espécies. O isolamento também pode ser realizado em meios específicos para dermatófitos, como DTM®, sendo a identificação do fungo baseada em alterações na cor do meio de cultivo, prática comum em diagnóstico microbiológico veterinário. Alguns laboratórios utilizam meios seletivos para fungos patogênicos, como agar Mycobiotic® e Mycosel® (AHMADI et al., 2015).

Por tratar-se de importante zoonose, acometendo principalmente pessoas imunocomprometidas e contactantes de animais, é de suma importância a vigilância de dados sobre as dermatofitoses também em medicina veterinária, bem como o aprimoramento e correta utilização e integração das ferramentas de diagnóstico, contribuindo para saúde e bem-estar dos seres vivos e ambiente. O objetivo deste trabalho é apresentar a correlação entre o cultivo microbiológico positivo para dermatófitos e o resultado da microscopia direta das amostras de pelos e crostas por isolados do Laboratório de Diagnóstico Microbiológico Veterinário da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro no período de 2012 a 2016.

CASUÍSTICA

Para a avaliação dos dados foram analisadas planilhas de organização de amostras e casuística, no período de janeiro de 2012 a dezembro de 2016, do Laboratório de Diagnóstico Microbiológico Veterinário da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Tais planilhas estavam organizadas no software Microsoft Excel® 2010. O isolamento dos dermatófitos foi feito a partir de amostras como pelos e crostas das bordas das lesões dos animais, acondicionadas e enviadas ao laboratório em envelopes de papel. No laboratório realizou-se a microscopia direta do material com solução clarificante KOH 20%, seguindo-se semeadura em Agar seletivo para fungos patogênicos (Merck®, Alemanha), com incubação a 28°C por até 30 dias. A identificação dos fungos foi realizada por observação de características macroscópicas das colônias, e principalmente, pela visualização e caracterização microscópica de macroconídios e microconídios (de Hoog et al. 2000/2017) (Figura 1).

Figura 1. Macroconídios de Microsporum canis (a), Trichophyton mentagrophytes (b) e Nannizzia gypsea (c) - Lactofenol Azul de Algodão, 400x.

Foram 162 cultivos positivos para dermatófitos, sendo 93 pertencentes a amostras de cães e 69 a felinos domésticos, sendo obtidos 173 isolados de dermatófitos. Das amostras com cultura positiva, 42 tiveram a visualização de hifas e artroconídios durante a microscopia direta dos pelos e crostas, sendo 24 de cães e 18 de gatos domésticos (Figura 2). Para o total de isolados, Microsporum canis prevaleceu com 107 isolados, seguido por 38 Trichophyton spp., 27 fungos do Complexo Nannizzia gypsea e 1 isolado de Nannizzia nana. De 9 cultivos positivos foram obtidos 2 dermatófitos distintos. Todas as amostras com microscopias direta positiva obtiveram resultado positivo no cultivo microbiológico.

Figura 2. Artroconídios presentes em amostras de pelos e crostas – Solução clarificante KOH 20%, 400x.

DISCUSSÃO

Corroborado por outras casuísticas e estudos (REF), a dermatofitose em cães e gatos continua tendo como principal agente etiológico o Microsporum canis. Além da já conhecida interação com estes hospedeiros, a facilidade para isolamento do fungo, bem como suas características macromorfológicas, como produção de pigmentos amarelados pelas colônias, e características microscópicas marcantes de seus macroconídios, auxiliam para a identificação da espécie e sua manutenção no topo das casuísticas sobre dermatofitoses em animais de companhia.

Outros fatores importantes associados a correta identificação do M. canis como agente causador da dermatofitose é o histórico dos pacientes, incluindo relatos de lesões dermatofíticas em seus tutores, bem como a contagem elevada de colônias obtidas em cultivo. Tais informações permitem caracterizar o quadro dermatofítico, e descartam esses pacientes de serem portadores assintomáticos do dermatófito (REF). Assim, bestabelece-se que nem todo isolado clínico de M. canis corresponda a um caso confirmado de dermatofitose. Estudos de casuística que levem em consideração a confirmação do quadro dermatofítico permitem melhor correlação entre este agente e a dermatofitose.

O isolamento de agentes pouco frequentes de pacientes assintomáticos, como Nannizzia gypsea, N. nana e Trichophyton spp., possivelmente tornam mais fácil a confirmação da dermatofitose apenas pelo resultado da cultura microbiológica. Fato este, que pode mascarar o real envolvimento destes agentes nos quadros clínicos quando comparados ao M. canis, sendo possivelmente, encurtada a diferença de importância destas espécies em casuísticas que considerem apenas cultivos positivos e quadros de dermatofitoses confirmados.

A considerável presença de isolados de espécies geofílicas, como N. gypsea e N. nana, frente a outros estudos (REF), possivelmente está relacionada as características geográficas e culturais nas quais se enquadram os pacientes do Hospital Veterinário da UFRRJ, área predominantemente rural e de vastas regiões arenosas, com constantes dispersões de poeira devido a fortes ventos. (REF) já atribuíram tais características regionais a surtos de dermatofitose por N. gypsea, reforçando os dados desta casuística.

O exame direto de pelos e crostas em pacientes com suspeita de dermatofitose pode ser realizado com o auxílio de diversas substâncias, como água destilada, corantes como azul de metileno e calcofluor-white, ou soluções clarificantes de NaOH, ou KOH. Estudos (REF) mostraram não haver diferença significativa na visualização de estruturas fúngicas em lâminas confeccionadas por estas diferentes técnicas, estando a acurácia dos resultados mais relacionada a capacidade técnica dos examinadores.

Assim, a utilização de soluções clarificantes (KOH 20 %) utilizadas nos exames desta casuística não mostrou-se grande interferente para a positividade dos dados. A baixa taxa de microscopias diretas positivas, neste caso, possivelmente relaciona-se ao fato de o laboratório ser constituído por médicos veterinários residentes em treinamento para o diagnóstico microbiológico, onde a capacidade de diagnóstico pela microscopia direta ainda está sendo aprimorada.

O fato de todas as amostras com resultado de microscopia direta positivo para dermatófitos terem tido posterior cultivo microbiológico positivo, mostra que embora não seja um exame de fácil execução, a visualização das hifas e artroconídios é confiável para o diagnóstico e confirmação da doença, sendo o resultado do cultivo micológico de importância apenas para identificação do agente.

O cultivo microbiológico feito em agar seletivo para fungos patogênicos confirmou-se como eficiente para a detecção de dermatófitos nas amostras. As características macroscópicas das colônias tornam-se nítidas devido a transparência do meio, o que pode ser extremamente prejudicado quando se utiliza meios com marcadores de pH cromogênicos, onde os corantes indicadores de mudança de pH mascararão muitas características (REF).

A utilização de tubos de ensaio, ao invés de placas de Petri, contendo agar para fungos patogênicos visou diminuir o ressecamento do meio de cultura, bem como reduzir o surgimento de microrganismos contaminantes, possivelmente mais frequentes em placas mal vedadas e mais propensas a acidentes (exemplo: abertura; rachaduras de tampas), conferindo maior segurança e integridade do meio por mais tempo para o isolamento dos dermatófitos. Apesar de eficaz, o isolamento em tubos tem a desvantagem da menor superfície de contato para as amostras, e pesquisas comparativas específicas devem ser realizadas para confirmar suas vantagens frente as placas de Petri.

Os dados desta casuística compactuam com os “guidelines” de diagnóstico da dermatofitose (REF), evidenciando a necessidade da utilização de diversas ferramentas de detecção dos fungos para o correto manejo da doença. A cultura fúngica, ainda considerada padrão ouro para o diagnóstico por alguns autores (REF), mostra-se realmente eficaz em situações onde outras ferramentas, como a microscopia direta das amostras, não apresentam resultados esclarecedores. Fatores primordias para utilização destas duas ferramentas de detecção de dermatófitos são seus baixos custos e fácil execução, embora a microscopia direta ainda exija certo treinamento e experiência para que forneça resultados satisfatórios.

CONCLUSÕES

Aliada ao exame direto, o cultivo microbiológico mostra-se ferramenta fundamental no diagnóstico e identificação do agente etiológico da dermatofitose, principalmente para confirmação de casos onde houve ausência de estruturas fúngicas no exame direto das amostras.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALLIZOND, V. et al. Advances in Microbiology, Infectious Diseases and Public Health: Fungal Occurrence in the Hair and Skin of Symptomatic Pets in Turin, Italy. In: Advances in Microbiology, Infectious Diseases and Public Health. Springer International Publishing, 2015. p. 55-62.

BIER, D. et al. Isolamento de dermatófitos do pelo de cães e gatos pertencentes a proprietários com diagnóstico de dermatofitose. Archives of Veterinary Science, v. 18, n. 1, p. 1-8, 2013.

CARDOSO, M. J. L. et al. Dermatopatias em cães: revisão de 257 casos. Archives of Veterinary Science, v. 16, n. 2, p. 66-74, 2011.

CAVALCANTI, M. P. et al. Frequência de dermatófitos e fungos saprófitas em caninos e felinos com sintomatologia sugestiva de dermatopatia micótica atendidos no Hospital Veterinário da UFRPE. Revista Clínica Veterinária, v. 56, p. 24-28, 2003.

CRUZ, M.; MARINHO, T.; COELHO, A. C. Pesquisa de dermatófitos em animais assintomáticos em clínica pediátrica. REDVET. Revista Electrónica de Veterinaria, v. 15, n. 3, p. 1-9, 2014.

FERREIRO, L. et al. Isolamento de dermatófitos e fungos saprotróficos do pelame de gatos sem dermatoses na região metropolitana de Porto Alegre-RS, Brasil. Acta Scientiae Veterinariae, v. 42, n. 1, p. 1-8, 2014.

KONDORI, N. et al. Comparison of dermatophyte PCR kit with conventional methods for detection of dermatophytes in skin specimens. Mycopathologia, v. 176, n. 3-4, p. 237-241, 2013.

KONEMAN, E.W. et al. Diagnóstico Microbiológico. 5. ed. Rio de Janeiro: MEDSI, 2008. 1465p.

MARKEY, B. et al. Clinical Veterinary Microbiology. 2. ed. Londres: MOSBY Elsevier. 2013. 901p.

MORIELLO, K. A. Treatment of dermatophytosis in dogs and cats: review of published studies. Veterinary Dermatology, Oxford, v. 15, n. 2, p. 99-107, 2004.

NENOFF, P. et al. Dermatomykosen durch Haus-und Nutztiere. Der Hautarzt, v. 63, n. 11, p. 848-858, 2012.

NEVES, R. C. S. M. et al. Retrospectiva das dermatofitoses em cães e gatos atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal do Mato Grosso, nos anos de 2006 a 2008. Ciência Rural, Santa Maria, v. 41, n. 8, p. 1405-1410, ago, 2011.

OVRÉN, E. et al. Dermatophytosis: fluorostaining enhances speed and sensitivity in direct microscopy of skin, nail and hair specimens from dermatology outpatients. Mycoses, v. 59, p. 436-441, 2016.

PROVERBIO, Daniela et al. Survey of dermatophytes in stray cats with and without skin lesions in Northern Italy. Veterinary Medicine International, v. 2014, 2014.

SCHERER, H. A. Estudo retrospectivo de dermatopatias em gatos através de diagnóstico histopatológico realizados no setor de Patologia Veterinária da UFRGS, Porto Alegre (1990-2012). 2015. 32 p. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária Preventiva e Patologia) – Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre-RS.

TERRENI, A.A. et al. Epidermophyton floccosum infection in a dog from the United States. Sabouraudia, v. 23, n. 2, p. 141-142, 1985.

DMU Timestamp: September 03, 2020 08:33